дихроичное зеркало что это такое
Что такое дихроическое зеркало?
Дихроичное зеркало. Что такое и как выбрать?
Флуоресцентные микроскопы с дихроичным зеркалом усиливают мелкие вещи, такие как клетки растений и животных, которые невооруженным глазом не могут восприниматься. С того момента, когда Захариас Янссен предположительно впервые изобрел сложный микроскоп, технология этого устройства была ответственна за большой прогресс человека в науке и медицине.
Одним из важных достижений, в частности, является изобретение флуоресцентного микроскопа, который опирается на светофильтр и отражения в соответствии с длиной волны для создания четких изображений. Для этого флуоресцентные микроскопы используют дихроичное зеркало. Покупая такое зеркало, те, кто серьезно относится к покупкам дихроичных зеркал для своего микроскопа, должны знать, как они работают, их преимущества и доступные типы.
Дихроическое зеркало: краткий обзор
Когда происходит фильтрация света от источника и изучение его отражения, дихроическое зеркало создает изображение, которое отличается от того, которое наблюдается в стандартных микроскопах. Эта форма фильтра попадает в категорию помех, поскольку она мешает как источнику света, так и отраженному свету внутри устройства.
Термины, синонимы к Дихроическому зеркалу
При покупке дихроичных зеркал важно знать все остальные термины и фразы, которые относятся к нему. Например, «дихроичные светоделители» и «диэлектрические зеркала» относятся к дихроичным зеркалам. «Дихроические» могут также относиться к материалам, которые избирательно поглощают свет в зависимости от состояния поляризации, поэтому некоторые люди используют термин «дихроматические светоделители», чтобы избежать путаницы.
Другие термины включают кросс-разветвитель, хроматический светоделитель, короткое замыкание с отражением и разветвитель цвета. Люди, которые только начинают познавать работу в флуоресцентной микроскопии, должны отметить, что эти термины, как правило, взаимозаменяемы.
Как работает дихроичное зеркало?
Флуоресцентные микроскопы используют дихроичные зеркала, особенно потому, что эти зеркала имеют покрытия с высокой отражательной способностью для более коротких длин волн и высокую передачу для более длинных волн.
Большую часть времени ученые используют их в сочетании с барьерными фильтрами и фильтрами возбудителя для создания фильтров для своих микроскопов.
Ориентация этих дихроматических зеркал обычно находится под углом 45 градусов к траектории света возбуждения, поступающего в куб через люминесцентный осветитель отраженного света. Их функция состоит в том, чтобы направлять выбранные длины волн через объектив и на образец. Они также имеют дополнительные функции пропускания длинноволнового света в барьерный фильтр и отражение любого рассеянного света назад.
Когда дихроичные зеркала отражают свет возбуждения в объективе, излучаемая флуоресценция, которая имеет более длинную длину волны, чем длина волны возбуждения, передает информацию через зеркало в научную камеру или фотоумножитель. Затем зеркало отражает лишний отраженный или рассеянный свет во второй раз. Более длинные волны движутся через фильтр, параллельный траектории начального падающего светового луча, в то время как более короткие длины волн отражаются вне оси. В идеале, дихроичные зеркала должны иметь острый разрез, бесконечную область передачи и широкую область отражения.
Преимущества дихроичного зеркала
Использование дихроичных зеркал имеет много преимуществ. Эти зеркала чисто разделяют спектр света между передачей и отражением, поглощая очень мало света. Эта низкая скорость поглощения также минимизирует риск термического напряжения и обеспечивает правильное и эффективное отражение зеркала. Они имеют спектральную стабильность независимо от рабочих температур или уровней влажности. Большинство из них также устойчивы к царапинам и имеют высокую степень механической устойчивости.
Длинноволновые против коротковолновых дихроичных зеркал
В общем, два вида дихроичных зеркал используются в обычном режиме. Оба вида зеркал выделяют свет через селективное отражение и передачу на основе длины волны. Длинноволновые дихроичные зеркала передают длины волн выше отсечки и отражают те, которые ниже него. С другой стороны, коротковолновые дихроичные зеркала пропускают ниже длины волны отсечки и отражаются над ней.
Как купить дихроичные зеркала?
Покупки таких зеркал просты и удобны в специализированном магазине. Введите «дихроические зеркала» или любые синонимы в панель поиска, присутствующие на всех веб-страницах лабораторного оборудования.
Дихроическое зеркало
Рис.1,Схема работы дихроических зеркал в Nikon RGB-матрица без светофильтровRGB
Дихроическое зеркало (дихроизм от греческого dikhroos — двухцветный) — дихроические зеркала и дихроические отражатели характеризуются цветом или цветами света, который они отражают. (А не цветом или цветами, который они передают (см. дихроизм для этимологии термина)).
Содержание
Дихроизм
Вообще дихроический материал, который разделяет видимый свет на лучи различных длин волн (цвета), отражая и пропуская в одном случае и материал, которым поляризуют световые лучи, выделяя нужные из общего спектра — во втором случае, производит раздвоение или разделение. Откуда пошло название. (Дихроический фильтр и дихроическое стекло).
Важность значения дихроизма может назначаться из контекста. Так, дихроидное зеркало, дихроидный фильтр, или разделитель луча, которые упоминаются как дихроические — применяют в первом случае, в более важном смысле; дихроический кристалл или материал, применяемый к абсорбирующему принципу при поляризации, обычно относят ко второму случаю. (Дихроизм и дисперсию в отношении разложения света следует различать).
Дихроические зеркала и дихроические фильтры
Если дихроические зеркала и дихроические отражатели определяются цветом или цветами света, который они отражают, а не цвет или цвета, который они передают (см. дихроизм для этимологии термина), то дихроический фильтр образует и передаёт свет(цвета) как насыщенный (интенсивный). Такие фильтры популярны и используются в архитектуре и театрах. Применяемые за источником света дихроические зеркала обычно отражают видимый свет вперед, позволяя невидимый инфракрасный свет (излученная высокая температура) пройти за пределами крепления, отражая пучок света, который «более прохладен».
Дихроические фильтры используют принцип вмешательства. Переменные слои оптического покрытия нанесены на задней поверхности стеклянного основания, выборочно усиливая определенные длины волн света интерферируя с другими длинами волны. Слои обычно депонируются в вакууме. Управляя толщиной и числом слоев, частота (длина волны) полосы пропускания фильтра может быть настроена и сделана столь же широкая или узкая по желанию. Поскольку нежелательные длины волны отражены, а не поглощены, дихроические фильтры не поглощают много энергии во время операции и не становятся столь горячими как эквивалентный обычный светофильтр (который пытается поглотить всю энергию за исключением энергии в полосе пропускания.
Физика работы дихроических зеркал и фильтров
Дихроические зеркала и фильтры в фотографии
Схема трехслойного пикселя Foveon X3 без светофильтров RGB
В настоящее время ведется интенсивная работа в области создания фотосенсоров, где необходимо избавится от фильтров Байера RGB — CCD фотосенсорах и от фотосенсоров — 3CCD-сенсоров (дорогостоящей, не компактной конструкции). Корпорация Nikon запатентовала способ изготовления фотосенсоров, который позволит в будущем решить эту задачу (См.Рис.1), (См. Nikon RGB-матрица). Разработанный Foveon X3-сенсор, который применяется фирмой Sigma (в фотокамерах Sigma SD14, Sigma SD15), параллельно решил эту задачу. Изображения с применением этих фотосенсоров по качеству передачи цветов не уступают цветной плёночной фотографии и находят широкое применение в студийных съёмках, съёмках на натуре, заповедниках и научных целях. Пока они работают без шума в пределах ISO 60—800 единиц. (Для сравнения фотосенсоры типа CMOS работают при ISO в диапазоне 100—3200 и более единиц). [1] [2]
Дихроическое зеркало
Рис.1,Схема работы дихроических зеркал в Nikon RGB-матрица без светофильтровRGB
Дихроическое зеркало (дихроизм от греческого dikhroos — двухцветный) — дихроические зеркала и дихроические отражатели характеризуются цветом или цветами света, который они отражают. (А не цветом или цветами, который они передают (см. дихроизм для этимологии термина)).
Содержание
Дихроизм
Вообще дихроический материал, который разделяет видимый свет на лучи различных длин волн (цвета), отражая и пропуская в одном случае и материал, которым поляризуют световые лучи, выделяя нужные из общего спектра — во втором случае, производит раздвоение или разделение. Откуда пошло название. (Дихроический фильтр и дихроическое стекло).
Важность значения дихроизма может назначаться из контекста. Так, дихроидное зеркало, дихроидный фильтр, или разделитель луча, которые упоминаются как дихроические — применяют в первом случае, в более важном смысле; дихроический кристалл или материал, применяемый к абсорбирующему принципу при поляризации, обычно относят ко второму случаю. (Дихроизм и дисперсию в отношении разложения света следует различать).
Дихроические зеркала и дихроические фильтры
Если дихроические зеркала и дихроические отражатели определяются цветом или цветами света, который они отражают, а не цвет или цвета, который они передают (см. дихроизм для этимологии термина), то дихроический фильтр образует и передаёт свет(цвета) как насыщенный (интенсивный). Такие фильтры популярны и используются в архитектуре и театрах. Применяемые за источником света дихроические зеркала обычно отражают видимый свет вперед, позволяя невидимый инфракрасный свет (излученная высокая температура) пройти за пределами крепления, отражая пучок света, который «более прохладен».
Дихроические фильтры используют принцип вмешательства. Переменные слои оптического покрытия нанесены на задней поверхности стеклянного основания, выборочно усиливая определенные длины волн света интерферируя с другими длинами волны. Слои обычно депонируются в вакууме. Управляя толщиной и числом слоев, частота (длина волны) полосы пропускания фильтра может быть настроена и сделана столь же широкая или узкая по желанию. Поскольку нежелательные длины волны отражены, а не поглощены, дихроические фильтры не поглощают много энергии во время операции и не становятся столь горячими как эквивалентный обычный светофильтр (который пытается поглотить всю энергию за исключением энергии в полосе пропускания.
Физика работы дихроических зеркал и фильтров
Дихроические зеркала и фильтры в фотографии
Схема трехслойного пикселя Foveon X3 без светофильтров RGB
В настоящее время ведется интенсивная работа в области создания фотосенсоров, где необходимо избавится от фильтров Байера RGB — CCD фотосенсорах и от фотосенсоров — 3CCD-сенсоров (дорогостоящей, не компактной конструкции). Корпорация Nikon запатентовала способ изготовления фотосенсоров, который позволит в будущем решить эту задачу (См.Рис.1), (См. Nikon RGB-матрица). Разработанный Foveon X3-сенсор, который применяется фирмой Sigma (в фотокамерах Sigma SD14, Sigma SD15), параллельно решил эту задачу. Изображения с применением этих фотосенсоров по качеству передачи цветов не уступают цветной плёночной фотографии и находят широкое применение в студийных съёмках, съёмках на натуре, заповедниках и научных целях. Пока они работают без шума в пределах ISO 60—800 единиц. (Для сравнения фотосенсоры типа CMOS работают при ISO в диапазоне 100—3200 и более единиц). [1] [2]
Принцип метода проточной цитометрии
1 Описание метода
Проточная цитометрия (другое название проточная цитофлюориметрия, Flow cytometry) – это измерение химических и физических свойств клеток по мере того, как клетки “протекают” одна за одной через точку интеграции, которой наиболее часто является лазер. Поскольку клетки рассеивают лазерный свет в различных направлениях, то свойства клеток, такие как их относительный размер и сложность структуры цитоплазмы, могут быть измерены. В цельной крови человека лимфоциты, моноциты, и гранулоциты могут быть различимы друг от друга просто потому, что рассеивают лазерный свет различным образом.
Рис. 1 Типичный профиль светорассеяния лизированной цельной крови
Большинство современных проточных цитометров могут измерять внешние клеточные свойства (экспрессию маркеров клеточной поверхности) или экспрессию внутриклеточных маркеров, содержание нуклеиновых кислот, активность ферментов и многое другое. Чтобы исследовать эти клеточные особенности, используются флуоресцентные реагенты, такие как антитела, конъюгированные с флуорохромом. Эти реагенты имеют характерные свойства светоизлучения, так что они могут быть обнаружены отдельно в различных параметрах флуоресценции.
Уникальным атрибутом проточной цитометрии является то, что флуоресценция на клеточном уровне или уровне частиц может быть измерена очень быстро. Когда флуоресцентно меченные клетки или частицы проходят через луч света, флуоресцентные зонды возбуждаются. Обнаружение испускаемого света и, в конечном счете, определенных клеточных свойств происходит со скоростью 10000 событий / секунду.
Рис.2 Спектры возбуждения и испускания для флуорохромов VioBlue®, FITC, and APC.
Проточная цитометрия используется как в клинических, так и в фундаментальных исследованиях: иммунология, трансплантация, гематология, неврология, исследования стволовых клеток, онкология, клеточная биология, молекулярная биология, разработка лекарственных препаратов, системная биология, морская биология, микробиология, вирусология и многие другие. Клинические исследования включают, в частности, диагностику in vitro, исследования в контексте испытаний или мониторинг пациентов после лечения. Некоторые клиники также используют проточную цитометрию для характеристики клеток донора и реципиента перед трансплантацией, чтобы снизить риск побочных эффектов после трансплантации.
2 Примеры применения проточной цитометрии
3 Принцип работы проточного цитометра
Проточный цитометр, например MACSQuant от Miltenyi Biotec, основан на системе, объединяющей флюидику, оптику и электронику.
3.1 Система флюидики
Гидродинамическая фокусировка используется для выравнивания и перемещения клеток или частиц через луч лазера. Жидкость протекает с постоянным давлением через проточную кювету. Клетки вводятся в середину потока обтекающей жидкости. По принципу ламинарного потока образцы клеток и обтекающая жидкость движутся в одном направлении, но остаются разделенными. Перепад давления между обтекающей жидкостью и образцами клеток определяет, насколько широк поток пробы по мере ее прохождения через проточную ячейку. Лазеры возбуждают флуоресцентно меченные клетки или частицы по отдельности, затем измеряются флуоресценция и светорассеяние.
Рис.3 Иллюстрация гидродинамической фокусировки прибора MACSQuant®
В исследованиях с применением проточной цитофлюориметрии, которые требуют очень высокого разрешения определенных популяций клеток, например, для анализа клеточного цикла, низкая скорость жидкости рекомендуется для генерирования узкого потока образца. Для применений в обычном иммунофенотипировании, любая скорость жидкости является подходящей. Однако важно, чтобы настройка скорости событий прибора не превышала 10000 событий в секунду для любой из скоростей потока.
3.2 Оптическая система
3.2.1 Фильтры и зеркала
После возбуждения лазером флуоресцентные реагенты, связанные с клетками или частицами, излучают свет, который обнаруживается в соответствии с их конкретным диапазоном длин волн. При использовании комбинации флуоресцентных красителей эти реагенты должны иметь отличающиеся спектры излучения. В системах MACSQuant используются различные оптические фильтры и дихроичные зеркала для направления света с определенной длиной волны на соответствующие флуоресцентные детекторы. Такое расположение создает так называемые каналы флуоресценции.
Различные типы фильтров определяют, какие длины волн могут входить в каналы флуоресценции. По своим оптическим свойствам они относятся к коротковолновым пропускающим, длинноволновым пропускающим, и полосовым светофильтрам. Проточные цитометры MACSQuant используют длинноволновые пропускающие и полосовые светофильтры.
Рис.4 Оптические фильтры
Иллюстрация функции длинноволновых пропускающих (Longpass; LP), коротковолновых пропускающих (Shortpass; SP) и полосовых (Bandpass; BP) фильтров. Длинноволновые пропускающие фильтры блокируют свет до определенной длины волны, тогда как коротковолновые пропускающие фильтры пропускают свет до определенной длины волны. Полосовые фильтры пропускают свет в определенном диапазоне длин волн.
Длинноволновые пропускающие фильтры обозначаются буквами LP и конкретным числом, например, LP 750. Это означает, что свет с длинами волн 750 нм и более может проходить через фильтр. Свет всех других длин волн будет заблокирован. Коротковолновые пропускающие светофильтры имеют аналогичное обозначение, например, SP 500. В этом случае свет с длинами волн 500 нм и меньше может проходить, тогда как оставшийся свет будет блокирован. Полосовые фильтры пропускают свет с определенным диапазоном длин волн. Полосовые фильтры обозначаются через буквы BP, за которыми следуют два числа. Первое число представляет собой среднюю точку диапазона длин волн. Второе число указывает диапазон длин волн в нм, который может пройти. Таким образом, свет, который может проходить через фильтр BP 525/50, находится в диапазоне от 500 до 550 нм.
Дихроичные зеркала, по существу, выполняют ту же функцию, что и фильтры, но ориентированы под углом 45 ° к пути света, тогда как фильтры ориентированы перпендикулярно пути света. Свет, который не может пройти через дихроичное зеркало, отклоняется под углом 90 ° к другому детектору света.
Оптические системы проточных цитометров MACSQuant сочетают в себе три лазера, различные фильтры и зеркала, что дает до 14 отдельных каналов флуоресценции и два канала рассеяния.
3.2.2 Фотонные детекторы – фотоэлектронные умножители (PMTs)
Путь света определенных длин волн, то есть флуоресцентных каналов, контролируется фотоэлектронными умножителями (ФЭУ). ФЭУ усиливают флуоресцентный сигнал, испускаемый флуорохромом, связанным с клеткой или частицей, и генерируют электрический ток.
Величина усиления зависит от напряжения, приложенного к каждому ФЭУ. Когда напряжение увеличивается, усиление обнаруживаемой флуоресценции также увеличивается, что приводит к более высокой средней интенсивности флуоресценции (MFI). И наоборот, когда напряжение уменьшается, усиление также уменьшается, что приводит к снижению MFI. Электрический ток, генерируемый ФЭУ, преобразуется в импульс напряжения внутри электронной системы.
3.3 Электроника
Электронная система проточного цитометра преобразует световые сигналы в пропорциональные электронные сигналы (импульсы напряжения), оцифровывает сигнал в соответствии с разрядностью аналого-цифрового преобразователя (АЦП) и взаимодействует с компьютером для передачи данных.
Преимущества цифровых проточных цитометров включают в себя:
Рис.5. Импульс напряжения
Когда клетка проходит сквозь луч лазера, прикрепленный флуорохром начнет флуоресцировать. Этот свет обнаруживается ФЭУ и запускает генерацию импульса напряжения. Когда клетка полностью входит в луч лазера, флуоресценция достигает пика излучения, что приводит к наибольшему пику импульса напряжения. Наконец, когда клетка покидает лазерный луч, обнаруживаемая флуоресценция уменьшается, импульс напряжения пропадает.
Импульс напряжения характеризуется его высотой (интенсивностью сигнала), шириной (интервалом времени) и площадью (излучаемая флуоресценция при прохождении клетки через лазерный луч).
Далее аналоговые сигналы преобразуются в цифровые сигналы для отображения данных в соответствии с разрядностью АЦП. Системы MACSQuant имеют 16-битный АЦП для всех параметров. Для площади импульса применяются дополнительные вычисления с 18-битной обработкой. Это означает, что для измерений площади импульса сигнал разлагается на более чем 253 000 частотных полос. Это позволяет использовать для отображения данных логарифмическую шкалу вплоть до пяти порядков.
4 Визуализация данных проточной цитометрии
Для визуализации данных значения каждого измеренного оптического параметра могут быть нанесены на график различными способами. Эти графики могут быть одномерными (гистограммы) или двумерными (точечные диаграммы).
4.1 Одномерные графики — гистограммы
Одномерные графики позволяют визуализировать один оптический параметр события (флуоресценции или рассеяния света). Для каждого события значения интенсивности сигнала каждого измеренного параметра сохраняются в файле данных. Когда события начинают накапливаться, генерируется «кривая», которая описывает распределение измеренных событий в соответствии с интенсивностью их сигнала.
Рис.6 Гистограмма, показывающая интенсивность флуоресценции в зависимости от количества событий
Интенсивность нанесенных на график сигналов увеличивается слева направо, т.е. клеточные популяции слева показывают меньшую интенсивность сигнала, чем популяции справа.
Одномерная гистограмма показывает распределение интенсивности флуоресценции.
4.2 Двумерные диаграммы — точечные диаграммы
Точечные диаграммы позволяют визуализировать два оптических параметра на одном графике. Положение события определяется двумя значениями, то есть интенсивностями сигнала для оптических параметров, отображаемых на осях x и y. Когда все события нанесены на график, события с аналогичными значениями интенсивности накапливаются в кластерах, которые могут представлять определенные клеточные популяции.
Рис.7 Точечная диаграмма, отображающая интенсивность двух параметров флуоресцентных сигналов
Двумерные точечные диаграммы позволяют одновременно визуализировать два оптических параметра.
На этом точечном графике клетки анализировали с использованием антител, конъюгированных с флуорохромами FITC и PE. График показывает клеточные популяции, которые являются либо отрицательными по обоим параметрам (нижний левый квадрант, LL), либо положительными по одному параметру (верхний левый (UL) и нижний правый (LR) квадранты), либо положительные по обоим параметрам (верхний правый квадрант, UR).
4.3 Двумерные диаграммы — диаграммы плотности
Диаграммы плотности отображают два параметра в виде распределения по частоте событий подобно точечной диаграмме, где каждой клетке соответствует точка. Кроме того, этот тип диаграмм изображает распределение клеток внутри популяции, характеризующейся очень высокой плотностью событий.
Рис.8 Диаграмма плотности
Диаграмма плотности показывает распределение клеток внутри популяции.
На этом графике плотности красный цвет представляет наибольшую плотность событий в клеточной популяции. С уменьшением плотности цвет переходит от желтого через зеленый к синему.
5 Источники
4 «Guide to Flow Cytometry» — Dako, Sonja Wulff, Colorado, USA